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應用毒理組

點閱: 3899
資料來源: 農業藥物毒物試驗所
更新時間: 2019/12/04

安全評估組

【目標】

應用毒理組之主要工作,為研究與評估藥毒物對人畜健康與環境安全之危害、藥毒物之風險評估研究與風險管理策略研析及安全評估試驗技術與品質規範之研訂。其目的在配合政府農藥管理之需求,技術支援植物保護工作,以確保農藥安全與有效使用,維護人體健康及生態環境之安全。本組於1996年完成建置無特定病原(SPF) 實驗動物飼育房,以支援各項動物毒理試驗,並於2010年3月獲得優良實驗室操作(GLP) 符合性登錄,協助廠商產品登記上市所需毒理資料之製備,以促進各項產業發展。同時研發基因毒性與水生生物毒性測試技術或實驗動物模式、組織病理檢驗與判讀技術、毒物或病原傷害標的器官研判等技術平台,以作為中毒或致病之證據,並積極探討致毒作用機制與對生物體內分泌或荷爾蒙的影響,據以評估各種藥毒物產品對人體潛在的危害性;另外負責鼠害防除技術之研究工作,以提供殺鼠劑效果評估,負責農產品致病菌與基因改造作物風險評估,負責微生物除草劑研發與安全評估,及訂定農藥人體健康風險之參考劑量(RfD) 值,以做為農藥殘留容許量標準及作物安全採收期之參考。

 

【工作重點】

風險評估 Risk Assessment

  • 農業環境及農產品致病性檢驗管理 Pathogenicity inspection of agricultural environment and products
  • 多重農藥危害及風險評估 Hazard and Risk Assessments of multiple pesticide exposures
  • 環境毒理研究 Environmental Toxicology Study
  • 賀爾蒙干擾作用之研究 Study of hormone interference
  • 賀爾蒙作用系統性評估 Systematic evaluation of hormone interference

 

GLP委託服務 Commissioning Service for GLP Study

  • 動物毒性試驗:急性毒性、微生物製劑致病性、出生前發育毒性Animal toxicity test: Acute toxicity, pathogenicity of biological product , prenatal developmental toxicity study
  • 致變異性 Mutagenicity test
  • 水生生物急毒性 Acute toxicity test of aquatic organism
  • 蜜蜂毒性、蚯蚓毒性測試、殺鼠藥效試驗 Toxicity study of bees, earthworm, and rodenticide
  • 理化試驗及殘留消退試驗 Physical chemical test and Residue analysis
  • 保健食品機能性與安全性試驗 Functional and safety test of healthy foods

 

【專長】

植物保護學、農藥學、應用毒理學、環境毒理學、動物病理學、生物化學、實驗動物學、動物生態學

 

【重要儀器設備】

動物房無菌無塵空調系統
動物房穿牆式大型殺菌釜
動物飼養隔離箱
水生養殖槽
無菌厭氧動物操作培養箱
活體影像系統
動物行為軌跡分析系統
動物用肺功能體積氣體測試儀
非侵入性尾套式血壓測量儀
呼吸毒性測試儀
呼吸毒性氣膠產生器
血液氣體及電解質分析器
自動血液細胞儀
微電腦尿液分析儀
血清生化酵素分析儀
微量凝血分析儀
連續式酵素免疫分析儀
生殖及致畸胎毒理鑑識儀
畸胎組織培養鑑定檢測儀
微生物自動辨識儀
細胞分選式流式細胞分析儀
細胞全光譜共軛焦影像分析儀
高速冷凍離心機
二氧化碳培育箱
倒立顯微鏡
組織包埋機
全自動石蠟組織切片機
包埋冷凍切片機
連續式自動染色機
5人座照相顯微鏡與影像處理儀
-80度冷凍乾燥裝置

 

【重要成果】

  • 化學藥劑對動物標準毒性測試體系之建立

農藥及其他物質藥劑對溫血動物毒理研究概況

  台灣有關農藥及其他物質對溫血動物急毒性之研究,本所首先於1983~1984年建立口服急毒性測試方法之規範與評估標準,並於1984年起正式接受國內農藥業界自行混合農藥上市前口服急毒性之毒理資料製備。口服急毒性是國內最早進行之化學藥劑對溫血動物毒性測試項目,草創之初,限於當時國內動物飼育條件的限制及其他實驗環境尚未週全,為配合當時農藥管理之初步運作,僅規定口服急毒性之測試得以一種動物小鼠(Mouse)進行試驗。至1991年由於國內實驗動物之品質與供應漸趨成熟,及對動物毒理試驗準則愈來愈完善,因此急毒性試驗朝向國際化,動物毒理資料需求及毒理試驗之準則(Guideline)應運而生,口服急毒性之試驗亦改以大鼠(Rat)為試驗動物,以配合農藥管理法之新規定。本所於1991年正式建置無特定病原(Specific pathogen free,SPF)之動物房,使國內農藥對動物毒理研究進入一新紀元,不僅毒理試驗研究品質提昇,試驗方法要求已與美國環保署所公佈之急毒性測試準則相同,因此毒理試驗報告,亦獲得國際認可。

  執行相關動物毒理試驗研究,最後皆需進行大體解剖,因此陸續建立實驗動物大體解剖流程,及病理檢查及組織切片製作流程,內容包括:麻醉、固定動物、放血,再一面採集血液或血清,以進一步進行血液相、白血球分類、血液凝固分析、血清生化與電解質分析等檢驗,另一面摘取腦、心、肝、肺、腎、脾、睪丸、子宮---等臟器,稱重並肉眼檢查臨床病理症狀,並進一步製作病理組織切片,以做光學顯微鏡檢查,並完成藥物對各種臟器影響之組織病理評估報告。

  由前述技術平台陸續建立符合國際標準的農藥及其他物質對溫血動物毒性(毒理)測試技術與體系,主要有藥物對動物急毒性測試體系、藥物對哺乳動物出生前發育毒性及後代繁殖毒性測試體系、農藥致變異性與致癌性快速篩檢評估體系、動物免疫功能測試體系、生物農藥對溫血動物安全評估流程等,目前完成之測試體系涵蓋毒理安全資料之大部分測試項目,重點包括急毒性、亞慢毒、慢毒性及環境生物毒性之測試體系。

急毒性及刺激性測試技術

急性毒試驗項目包括:口服、皮膚及呼吸急毒性、眼及皮膚刺激性、皮膚過敏性及遲發性神經毒性等七種。目的為評估試驗物質經由不同途徑暴露對哺乳動物急性毒性及刺激性,作為藥劑之安全等級分類,及初步得知試驗物質之毒性作用。試驗所得之數據(如LD50),可估算亞慢性毒性試驗或長期毒性試驗之劑量。

毒性試驗 毒性試驗
口服急毒性試驗
(一)口服急毒性試驗(大鼠或小鼠)
皮膚急毒性試驗
(二)皮膚急毒性試驗(大鼠)
呼吸急毒性試驗
(三)呼吸急毒性試驗(大鼠)
眼刺激性試驗
(四)眼刺激性試驗(兔)
皮膚刺激性試驗
(五)皮膚刺激性試驗(兔)
遲發性神經毒性試驗
(六)遲發性神經毒性試驗(蛋雞)
皮膚過敏性試驗
(七)皮膚過敏性試驗(天竺鼠)
 

28天及亞慢毒性餵飼測試技術

  以大鼠(rats)或小鼠(mice)作為試驗動物,測試試驗物質經由重覆持續餵飼28或90天後對哺乳動物之潛在毒性,得知試驗物質之作用器官及毒性變化。檢測項目包括:臨床症狀、發生率、死亡率、眼底鏡檢查、體重、飼料消耗量、飼料利用率、血液學檢查(約9項)、血液凝固檢查(約4項)、血清生化與電解質檢查(約20項)、尿液學檢查(約7項)、臟器重(約7項)、肉眼及病理觀察(約30項)等,求出無毒害作用量(no observed adverse effect level, NOAEL, mg/kg/bw),可作為慢性試驗劑量範圍選擇依據。

一、試驗物質強迫灌食或餵飼處理:
毒性試驗 毒性試驗
藥物經由混拌罐混拌飼料
(一)藥物經由混拌罐混拌飼料
飼料混拌藥劑後置於飼料盒內
(二)飼料混拌藥劑後置於飼料盒內
飼料混拌藥劑後餵飼
(三)飼料混拌藥劑後餵飼(大鼠或小鼠)
經由胃管強迫灌食
(四)經由胃管強迫灌食(大鼠或小鼠)
二、試驗觀察及臨床相關生化檢查:
毒性試驗 毒性試驗
體重變化記錄
(一)體重變化記錄(大鼠)
臨床症狀觀查
(二)臨床症狀觀查
眼底鏡檢查
(三)眼底鏡檢查(大鼠)
視網膜檢查
(四)視網膜檢查
血液採集
(五)血液採集(大鼠)
尿液採集及尿渣分析
(六)尿液採集及尿渣分析(大鼠)
尿液生化檢查
(七)尿液生化檢查
血液學檢查
(八)血液學檢查
血液凝固檢查
(九)血液凝固檢查
血清生化與電解質檢查
(十)血清生化與電解質檢查
三、肉眼及組織病理檢查:
毒性試驗 毒性試驗
大體解剖
(一)大體解剖
臟器秤重記錄
(二)臟器秤重記錄
組織修片
(三)組織修片
組織切片製作
(四)組織切片製作
組織修片
(五) 共軛焦顯微鏡檢查
組織切片製作
(六)組織切片染色與病變記錄

出生前發育毒性研究

本實驗室建立出生前發育毒性測試方法,以免賴得、貝芬替、三苯醋錫、大滅松、甲基多保淨、芬佈賜、亞環錫、必芬諾、甲氧基護谷、三泰芬、2.4-地等十一種藥劑測試其細部骨骼異常情形,除統計顯著性判斷藥物反應外,若與背景資料比較,對該農藥畸形作用便具有生物意義。據上述資料推論,免賴得與貝芬替為明顯對大鼠誘發畸形性,其餘藥劑則屬輕度或無致畸形性。

出生前發育毒性研究1
另為建立快速篩選可能致畸胎藥劑方法,本研究室以懷孕第 10.5 天之大鼠胚胎為試驗對象,於大鼠懷孕第10.5天時將胚胎取出培養於37℃恆溫培養箱培養48小時,其後評估其蛋白質含量、去氧核醣核酸(DNA)數、生長發育及形態(morphology)、培養基酸鹼值等。發育與形態評估方法依Brown 和 Fabro (1981)方法。

出生前發育毒性研究2

後代繁殖毒性研究

本試驗建立對後代繁殖毒性之測試方法,測定大鼠取食含免賴得藥劑之飼糧,其第一或第二子代之性腺功能、動情周期、配種行為、懷孕、分娩、泌乳、離乳及生長等性狀之異常現象。

後代繁殖毒性研究1

目前生殖毒性測試方法乃以連續三代之大鼠子代在動情週期、配種、懷孕、分娩、泌乳及哺乳等生殖性狀與攝食量、子代體重等生長性狀為主要考量。但全程試驗費時且耗財,試驗評估項目經常未能適切顯示藥劑之影響,基於此因素,發展快速、省錢之測試技術有其必要性。另為建立體外生殖毒性試驗,利用包含動物卵子(oocyte)、精子(spermatozoa)、胚(embryo)或胎(conceptus)及體外授精(in vitro fertilization)。生體外(in vitro)生殖毒性試驗無法取代目前生體內(in vivo)方法,但可快速篩選潛在致生殖毒性之化學藥劑。

後代繁殖毒性研究2

圖A對照組鼷鼠胚胎體外授精後胚胎發育情形,包含桑椹胚和囊胚;圖B為農藥甲對胚胎發育影響不大,有胚胎可發育至擴張囊胚;圖C為農藥乙對胚胎發育影響頗大,大部份卵子未授精或發育停滯;圖D為正對照藥劑Aroclor-1254誘發卵子或胚胎死亡。以上均為體外授精後96小時結果。

後代生殖毒性研究

本試驗主要目的在建立對後代生殖毒性之測試方法,測定大鼠取食含免賴得藥劑之飼糧,其第一或第二子代之性腺功能、動情周期、配種行為、懷孕、分娩、泌乳、離乳及生長等性狀之異常現象。本實驗室已建立後代生殖毒性測試方法,生殖毒性之試驗期一般為一年半,本實驗室以免賴得0、500、1000、1500、2000、2500、3000 ppm 進行後代生殖毒性研究,結果顯示,親代方面,雌與雄鼠之體重、飼料攝食量、動情週期、配種指數、受胎指數、懷孕指數、懷孕期、著床數、大體解剖之弱眼病理檢查、器官重及組織病理檢查等均與對照組無明顯差異; 子代方面,臨床症狀及死亡率、新生子鼠平均數、性比率、存活指數(出生第0、4、21天)、體重、大體解剖病理檢查等均與對照組無明顯差異。究其原因,可能由於藥劑在飼料中消退快及劑量不夠高之故。

後代生殖毒性研究

目前生殖毒性測試方法乃以連續三代之大鼠子代在動情週期、配種、懷孕、分娩、泌乳及哺乳等生殖性狀與攝食量、子代體重等生長性狀為主要考量。但全程試驗費時且耗財,試驗評估項目經常未能適切顯示藥劑之影響,基於此因素,發展快速、省錢之測試技術有其必要性。體外生殖毒性試驗已發展多年,試驗對象包含動物卵子(oocyte)、精子(spermatozoa)、胚(embryo)或胎(conceptus)及體外授精(in vitro fertilization)。儘管生體外(in vitro)生殖毒性試驗無法取代目前生體內(in vivo)方法,但可快速篩選潛在致生殖毒性之化學藥劑。並可用以探討致生殖毒性之機制及輔助進行風險性評估(risk assessment)。本研究室將以已知於生體內致生殖毒性藥劑免賴得(benomyl)與貝芬替(carbendazim)為陽性對照組,建立生體外致生殖毒性快速測試方法,本年度將以大鼠及小鼠之卵子、精子、胚或胎及體外授精為試驗對象。

快速誘導致肝癌動物模式之研究

以大鼠(rats)或小鼠(mice)作為試驗動物,第0天腹腔注射癌誘發物(initiator) Diethyl-nitrosamine (DEN) 200 mg/kg bw,第2週時飼料(或飲水)添加癌促進物(promoter) 2-acetylaminofluorene (2-AF) 200 ppm餵飼大鼠,第3週進行部分肝切除手術,並於8週後觀察肝腫瘤形成。試驗記錄飲水量、體重、血清酵素變化、肝腫瘤形成組織病理及g-GT前癌酵素陽性灶等項目變化。試驗結果,以2-AAF處理組飲水量在4週並無減少現象,但第6至12週則有逐漸減少(p<0.05);第8週後體重下降;絕對及相對肝重於第4週有減輕、第6週組則逐漸增重(p<0.05);肝臟酵素ALT及AST於處理後4至8週組呈顯著性上升,g-GT值隨處理時間延長上升更明顯(p<0.05)。肝臟組織病變於處理第8週有明顯膽管上皮增生及g-GT前癌性病灶區面積增加,第8週後肝腫瘤結節開始形成。快速誘導致肝癌動物模式可確立化學致癌物於短期內誘導肝癌之形成,進而縮短試驗物質致癌潛在毒性試驗期。

快速誘導致肝癌動物模式之研究1

毒性試驗 毒性試驗
部份肝切除手術
(一)部份肝切除手術
活體影像系統評估腫瘤形成
(二)活體影像系統評估腫瘤形成
因肝腫瘤而腹部脹大
(三)因肝腫瘤而腹部脹大(大鼠)
肝表面腫瘤結節形成
(四)肝表面腫瘤結節形成(大鼠)
正常肝細胞
(五)正常肝細胞
肝腫瘤細胞
(六)肝腫瘤細胞
對照組肝細胞g-GT染色
(七)對照組肝細胞g-GT染色
肝腫瘤細胞呈g-GT陽性反應
(八)肝腫瘤細胞呈g-GT陽性反應

快速誘導致肝癌動物模式之研究2

快速誘導致肝癌動物模式之研究3

  • 完成遺傳致變異測試體系
農藥之致變異性簡速測試技術
試驗體系 毒性標竿 毒性測試
活體外試驗
In vitro assays
基因突變 細菌基因逆向變異試驗
Bacterial reverse mutation test
DNA傷害與修復 枯草桿菌重組檢定試驗
Rec assay in Bacillus subtilis
細胞姊妹染色體交換試驗
Sister chromatid exchange assay in mammalian cell
染色體畸變 體外微核試驗
In vitro micronucleus test
活體內試驗
In vivo assay
染色體畸變 鼷鼠紅血球微核試驗
Mouse erythrocyte micronucleus test

細菌基因逆向變異試驗
細菌基因逆向變異試驗  (Bacterial reverse mutation test )

枯草桿菌重組檢定試驗
枯草桿菌重組檢定試驗 (Rec assay in Bacillus subtilis)

細胞姊妹染色體交換試驗
細胞姊妹染色體交換試驗  (Sister chromatid exchange assay in mammalian cell )

體外微核試驗
體外微核試驗  (In vitro micronucleus test)

鼷鼠紅血球微核試驗
鼷鼠紅血球微核試驗 Mouse erythrocyte micronucleus test

  • 完成微生物製劑對動物安全評估技術

台灣生物科技產物及其製劑對溫血動物之毒理研究概況

近年來,由於生物科技的突飛猛進及世界綠色永續經營的新潮流,使得越來越多的生物科技產物,進入我們的飲食起居的生活環境中,目前生物科技產品,包括生物農藥、微生物製劑、生化製劑、農產保健食品及基因改造生成的製劑等陸續被研發登記上市,這些產品之藥效或功效是生技業界最關切的要點,但是生物科技產品是否具有毒性或對人體產生不良副作用等安全評估,亦是決定各種生技產品能否開發成功上市之關鍵。

台灣生物製劑研發甚早,唯多僅止於實驗室研究階段未能生產上市,自1990年國外蘇力菌大量引進國內應用,國內亦積極研發生物製劑,希冀能取代化學藥劑於田間應用。唯生物製劑研發上市,必需製備毒理資料以支持其使用安全性,因此,政府自1991年首度參照美國1989年環保署公告之微生物製劑毒理資料需求之準則並審視國內現況加以修正,完成農用微生物製劑第一階(Tier I)毒理資料要件,並由藥毒所配合研發各項毒理測試技術。

本組積極從事微生物製劑在哺乳動物體內分佈、停留、清除及對動物標的器官可能產生效應等相關毒理研究,並考量我國實際應用現況,及參考歐、美、日等國對生物製劑之毒理試驗準則,至1995年已完成生物農藥微生物製劑對溫血動物理測試安全評估體系,含涵蓋農委會與環保署公告之微生物製劑必需毒理試驗資料項目,包括:口服急毒性/致病性、皮膚急毒性/致病性、肺急毒性/致病性、眼刺激性/致病性、皮膚過敏性、靜脈注射毒性/致病性、及對鳥禽類口服急毒性/致病性。這是目前台灣微生物製劑對溫血動物安全性評估最完整的體系,可技術支援政府對微生物製劑安全管理工作外,並可協助國內生技業界自行開發的生物製劑配方或產品提供安全性評估服務,除可保障消費者健康安全,並提昇國內生技產品的競爭力。至於特殊微生物製劑如微生物代謝產物之毒性、病毒類之細胞組織養養及免疫系統安全性等之評估技術,正陸續發展中。

微生物製劑及生物科技產品安全性

一、微生物製劑口服急毒性與致病性安全評估

評估由本所生物藥劑組及國內試驗機構提供的蘇力菌(Bacillus thuringiensis)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、蔥頭假單胞菌(Pseudomonas cepacia)、黑殭菌(Metarhizium anisopliae)、蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)、綠殭菌(Nomuraea rileyi)、白殭菌(Beauveria bassiana)、木黴菌(Trichoderma spp.)、螢光假單胞菌(Pseudomonas putida)等對大鼠口服急毒性/致病性試驗,發現上述9種菌體於動物體內被清除的主要方式,經由消化道糞材排出,排出量集中於接種後 1天內,排出數量隨時間遞減。而部份菌種如蠟蚧輪枝菌、綠殭菌處理大鼠後第1天,其消化道、糞材、臟器及血液之微生物培養,均未檢出投予的菌體菌落,可見綠殭菌孢子經由口服後不易在大鼠體內存活,很快的失去活性。此與蘇力菌、黑殭菌及白殭菌孢子可在大鼠胃腸道內容物及糞材中存活2-14天差異甚大。

進一步以不同溫度的人工胃液(simulated gastric fluid, SGF),以同為真菌類的黑殭菌及白殭菌108 cfu活孢子進行存活試驗比較。在反應不同時間後,黑殭菌孢子在人工胃液中存活最久,可達第5天,其次為白殭菌孢子,可存活至24小時,而綠殭菌孢子則完全不具活性,推測綠殭菌孢子較不易抵抗大鼠消化系統的作用,且在正常動物體溫約37℃下,極可能喪失存活能力,這與體內試驗可見綠殭菌孢子經口進入體內,幾乎在1天內完全失去發育能力相同,可見綠殭菌孢子對哺乳類動物較不具潛在的風險性。

另外,塗抹培養動物各組織臟器,大部分未檢出投予菌體菌落,惟上述部分菌體可在大鼠肺臟、脾臟、肝臟及腸繫膜淋巴結中檢出,其中蘇力菌孢子在脾臟至第4週後仍可檢出。脾臟組織是所有組織臟器中檢出率最高器官組織,且停留時間最長,顯現微生物製劑的標的器官與一般化學藥劑在肝臟代謝不盡相同,更說明微生物製劑安全評估的特殊性,不能強制套用化學藥劑的毒理安全評估系統。

二、微生物製劑肺急毒性與致病性安全評估

評估前述9種菌體對大鼠肺急毒性/致病性實驗,發現大鼠經氣管灌注後,無任何明顯的臨床症狀或死亡,但在肺臟組織呈現局部的病理變化病變。進一步進行組織塗抹培養(圖一)及病理組織切片檢查,發現只在氣管灌注後第1天孢子具存活發育能力,但並未發現發育的孢子(孢子形態仍保持完整)、菌絲或任何增殖的證據(圖二),顯示這些菌體僅對大鼠肺臟造成正常的異物性肺炎反應(圖二)。

試驗中以同等數量的綠殭菌及蠟蚧輪枝菌孢子進入肺臟組織後,發現孢子喪失存活能力,無論在數量或時間上均比蘇力菌或同為真菌類的黑殭菌孢子多且快。此是否與綠殭菌及蠟蚧輪枝菌孢子較易受動物體的影響,或與不同的孢子種類構造有關,或如同人工胃液消化反應試驗一樣,受溫度影響較大有關,有待進一步探討。

三、生物科技產品核多角體病毒之安全性評估

以1x108 PIB/ml之Spodoptera litura核多角體病毒 (nucleopolyhedrovirus, NPV) (SpltNPV) 包涵體,進行大鼠口服 (10 ml/kg體重) 與氣管灌注 (1 ml/kg體重) 毒性與致病性之安全評估。口服與肺急毒性試驗以 Spraque-Dawley (SD) 品系大鼠分為A、B、C、D、E共5組,其中A-C為處理組,D與E組為高壓滅菌與空白組,分別在第1、3及21天評估致死率、臨床症狀、組織病變、體增重、臟器重量、血液學、血清生化、血清蛋白電泳、聚合酶鏈鎖反應偵測病毒與組織病理。結果顯示經SpltNPV口服後無任何大鼠死亡,亦無明顯的臨床症狀,體重增重、肉眼病變等與對照組比較亦無明顯差異,臟器重量方面第21天處理組大鼠肝臟顯著低於滅菌組。大鼠氣管灌注後肺臟可見明顯的發炎反應(圖三),體重除第1及第3天顯著低於空白組 (p<0.05) 外,第21天體重則無明顯差異;血清生化分析顯示尿酸 (Uric acid) 顯著高於空白組 (p<0.05);處理組與滅菌組肝臟重量組織顯著低於對照組,肺臟重量則顯著大於對照組。血清蛋白方面,口服與氣管灌注試驗第1、3與21天處理組及對照組大鼠皆具相似之SDS-PAGE血清蛋白圖譜與濃度(圖四、圖五)。經由 (35/36) 引子監測臟器內純化的DNA,並未在大鼠肺臟與其他組織臟器增幅出680bp的病毒基因片段(圖六)。綜合上述結果顯示,SpltNPV對大鼠無明顯之口服與肺急毒性或致病性。此試驗研究除了建立較完整之病毒類生物科技產品對溫血動物之安全評估系統外,並可支援SpltNPV此類產品之商品化及對此類產品管理政策訂定之參考。

四、微生物製劑潛在的風險

(一) 過敏反應的風險

由於部分微生物製劑成品以餌劑方式使用於室內防治害蟲,使得此類微生物製劑易存在於人類居住的環境中,加上真菌類除了菌絲本身外其孢子等亦可能為一過敏原物質,可經由呼吸系統進入動物體而造成潛在的系統性過敏反應。評估白殭菌粗抗原對大鼠之過敏性反應中,發現處理組大鼠肺泡灌流液中的細胞總數、嗜酸性球數目、過敏抗體IgE及過敏細胞素IL-4均比佐劑對照組明顯地上升(圖七);在肺臟組織切片下,亦可見高劑量組大鼠呈現局部肺臟組織明顯的嗜酸性球浸潤。顯示高劑量的白殭菌粗抗原對大鼠可能具潛在的過敏反應,與Ward等人(2000)以黑殭菌粗抗原,經呼吸及腹腔途徑給予易過敏品系小鼠,亦導致潛在的過敏反應相似。推估部分微生物製劑孢子、菌絲等成分,對人類健康仍具有潛在的風險性,在應用微生物製劑時,操作者應戴防護口罩,以降低因個人易過敏體質之差異,導致潛在性的過敏風險。

(二) 代謝產物的風險

微生物製劑在製程中,無論最後產品是以微生物本身或代謝產物或二者合一,在其醱酵期間所產生的代謝產物常含於最後產品中,這些已知或未知的代謝產物,可能是蛋白質類或非蛋白質類,其對哺乳類動物的影響均十分不清楚,使得微生物製劑的安全性再度受到重視。

大部份的生物製劑的代謝產物,除了具有殺菌(抗生素類)及殺蟲作用外,部份甚至對哺乳動物產生明顯的影響,如蘇力菌素(thuringiensin),又稱-外毒素(beta-exotoxin),對大鼠口服急毒性LD50約170 mg/kg或大於5,000 mg/kg,呼吸急毒性LC50為0.024 mg/L或大於0.3 mg/L,其在呼吸急毒性分類上屬於極劇毒物質。又如,放射線菌屬(Strptomyces spp.) 代謝產物borrelidin及黑殭菌代謝產物黑殭菌素 (destruxin),可抑制哺乳動物的血管生成(angiogenesis)作用及血癌細胞(leukemic cell)之增殖作用。再如,不同的枯草桿菌菌株的代謝產物至少有11種,alcalase, bacillomycin, bacilysin, botrycidin, chlorotetain, fengycin, iturin A, mycosubtilin, rhizocticins, subtilin及surfactin等,其中alcalase為一致過敏原。由此可知部份已知代謝產物確實具有毒性,使得世界衛生組織(WHO)對蘇力菌素可能造成人體的潛在危險性相當重視,並明定蘇力菌製劑不應含有蘇力菌素,我國動植物防檢局亦依此在2004公告修訂蘇力菌產品規格不得檢出(農授防字第0931484110號)。

蘇力菌素可由不同的蘇力菌(Bacillus thuringiensis)菌株產生,研究上首度探討蘇力菌素引起肺毒性作用機制(如圖八),可能與蘇力菌素造成大鼠肺臟組織中氧化及抗氧化酵素(SOD及GSH)不利的狀態有關;並首度證實蘇力菌素可活化大鼠大腦皮質腺核苷酸鹽環化酶(adenylate cyclase, AC)酵素的活性,使cAMP濃度增加,進一步將蘇力菌素歸為AC的部份促進物(a partial agonist)。本研究成果亦發表於Toxicology and Applied Pharmacology 期刊。

綠殭菌孢子在SMAY培養基塗抹培養生長之情形
圖一、綠殭菌孢子在SMAY培養基塗抹培養生長之情形。(A)標準品綠殭菌孢子經培養6或9天;(B)綠殭菌孢子及分生孢子之形態(每小格為0.1 mm);(C)氣管灌注後第1天肺臟組織塗抹培養6或9天,孢子可存活及發育;(D)氣管灌注後第3天之肺臟組織塗抹培養9天,未見孢子發育。(資料來源,張等,2006)。

大鼠氣管灌注綠殭菌或蠟蚧輪枝菌孢子後的肺臟組織病理變化
圖二、大鼠氣管灌注綠殭菌或蠟蚧輪枝菌孢子後的肺臟組織病理變化。(A)正常肺臟組織 (100或1,000X, H&E stain);(B)投予後第1-3 天肺臟組織可見染成紅色的孢子、肺泡腔大量滲出液浸潤及孢子的殘留顆粒 (100或1,000X)。(C)投予後第1天肺臟組織以特殊染色,可見被染成紅色且完整的的蠟蚧輪枝菌孢子(1,000X, PAS stain)。(資料來源,張等,2006)。

大鼠氣管灌注Spodoptera litura病毒包涵體後的肺臟組織病理變化
圖三、大鼠氣管灌注Spodoptera litura病毒包涵體後的肺臟組織病理變化(100 or 400 X);(A) 投予後第1天肺臟組織可見肺泡腔大量滲出液;(B) 投予後第3天肺臟組織可見肺泡壁有少許增生;(C) 投予後第21天可見肺泡壁明顯增生。

口服接種Spodoptera litura病毒包涵體後大鼠之血清蛋白SDS-PAGE圖
圖四、口服接種Spodoptera litura病毒包涵體後大鼠之血清蛋白SDS-PAGE圖。

氣管接種Spodoptera litura病毒包涵體後大鼠之血清蛋白SDS-PAGE圖
圖五、氣管接種Spodoptera litura病毒包涵體後大鼠之血清蛋白SDS-PAGE圖。

PCR偵測口服 Spodoptera litura 病毒包涵體21天之大鼠脾臟
rat β-actin
圖六、PCR偵測口服 Spodoptera litura 病毒包涵體21天之大鼠脾臟。

大鼠以不同白殭菌粗抗原致敏劑量(sensitizing dose)或佐劑處理1大鼠以不同白殭菌粗抗原致敏劑量(sensitizing dose)或佐劑處理2
圖七、大鼠以不同白殭菌粗抗原致敏劑量(sensitizing dose)或佐劑處理後,中高劑量組(7.5, 15 μg)的支氣管肺泡灌洗液中之過敏抗體IgE及過敏細胞素IL-4濃度,顯著性上升。(資料來源,蔡等,2003)

蘇力菌素引起肺毒性作用機制
圖八、蘇力菌素引起肺毒性作用機制

生物科技產物毒理測試技術

毒性試驗 毒性試驗
皮內刺激性測試
皮內刺激性測試 (Intracutaneous test)
口服毒性/致病性測試
口服毒性/致病性測試 (Acute oral toxicity/pathogenicity)
肺急毒性/致病性測試
肺急毒性/致病性測試 (Acute pulmonary toxicity/pathogenicity)
腹腔急毒性/致病性測試
腹腔急毒性/致病性測試 (Intraperitoneal oral toxicity/pathogenicity)
靜脈急毒性測試
靜脈急毒性 (Acute intravenous toxicity)
致病性測試
致病性測試 (pathogenicity)
禽類急毒性測試
禽類急毒性 (An avian oral toxicity)
致病性測試
致病性測試 (pathogenicity)

生物科技產物測試之特殊性

化學性農藥可依劑量與生物效應進行測試,目的強調化學物質之毒性,而生物製劑之測試,因微生物之生物本質是主要考量因素,於大多數生物製劑均含有微生物活體,因能自行生長繁殖,並具感染性,因此利用動物之測試體系考量層面不同,其測試特殊性可歸納為三項:

一、測試方法的不同:

(一)毒性測試期不同:
生物製劑於哺乳類及魚類測試期分別為1至2個月及30天,而一般化學性農藥對哺乳類動物急毒性測試期為14天,魚急毒試驗僅需4天,且生物製劑之魚毒試驗一般採靜置式試驗(Static test),化學性農藥測試法則採循環式試驗(Flow-through test)。

(二)投予劑量的不同:
生物製劑一般給予生物活體之最高劑量(108以上的cfu或IU單位),而化學性農藥是以每公斤體重投予多少毫克作為投予單位。

(三)投予途徑的不同:
一般化學性農藥主要投予途徑為口服、皮膚接觸、呼吸等途徑,生物製劑則需增加氣管、靜脈及腹腔等投予途徑,以增強安全之評估。

二、.測試過程的特殊性:

(一)生物製劑注重測試對生物特性的監測(qualification) :
此特殊性需加以特別注意,由於微生農藥含有微生物,試驗投予前,應針對不同的微生物品種,選擇其適合的溫度、培養基及pH值,以瞭解測試樣品的生物活性。

(二)回收培養(recovery culture):
微生物投予後,於動物各組織器官需進行特殊回收培養的試驗,以瞭解微生物在動物體內的感染、分佈情形。

回收培養判讀
回收培養判讀

三.評估的指標不同:

生物製劑藉由回收培養之微生物的數量,及組織病理學的檢驗,以觀察感染性及致病性,此與化學性藥劑較注重短期的急性死亡,及長期之組織毒害的評估指標不同。

追蹤孢子在組織發育及分佈
追蹤孢子在組織發育及分佈

  • 完成SPF動物房微生物監測系統

無特定病原(SPF)動物房之管理及實驗動物健康監測

為應相關毒理試驗研究之基礎需求,本所應用毒理組於1991年已建置符合國際標準之無特定病原(Specific Pathogen Free,SPF)實驗動物飼育房乙座,面積二百坪,為國內中南部地區規模最大且完善,且符合國際標準之實驗動物房設施。另為維護SPF實驗動物不受致病微生物之感染,實驗動物及相關環境設施必須具備嚴密之微生物監測系統,以確保實驗動物品質,及各種毒性測試結果品質要求,陸續建立無特定病原(SPF)實驗動物房實驗操作手冊,及SPF實驗動物健康監測體系,以支援各種動物毒理試驗,提升動物毒理試驗品質及水準。又配合國際實驗室認證制度,推展毒理研究之優良實驗操作規範(GLP),以強化學術交流。並應「動物保護法」之規定,本所已成立「動物實驗管理小組」,以協助監督相關實驗動物科學試驗研究之進行。

無特定病源(SPF)動物房之管理

動物房管理 動物房管理
SPF動物房之平面配製圖
SPF動物房之平面配製圖
SPF動物房之日常清理情形
SPF動物房之日常清理情形
動物觀察
動物觀察
SPF動物房之環境微生物監測
SPF動物房之環境微生物監測

SPF實驗動物健康(微生物)監測

Health (Microbiological) monitoring of laboratory rodents
動物監測 動物監測
解剖動物進行細菌培養
解剖動物進行細菌培養
細菌生化試驗管
細菌生化試驗管
病原血清抗體分析之試驗
病原血清抗體分析之試驗
寄生蟲監測系統鏡檢法
寄生蟲監測系統鏡檢法
  • 完成化學藥劑對水生物毒性測試體系

農藥對水生生物毒性之試驗研究

本組參考經濟合作發展組織(OECD)及美國環保署所推薦之斑馬魚做為試驗魚種,檢測農藥、環衛用藥或化學品之水生毒性,以供水生環境安全評估之參考。本組於2010年建立斑馬魚循環式養殖系統,並於2012年取得優良實驗室操作(GLP)之認可,為國內目前唯一符合GLP規範之水生毒性試驗單位。另於2013年建立水蚤毒性試驗之檢測方法,提供水生無脊椎動物安全評估之試驗體系。

水生物毒性測試 水生物毒性測試
斑馬魚循環養殖系統
斑馬魚循環養殖系統
斑馬魚
斑馬魚
水蚤毒性試驗
水蚤毒性試驗斑
斑馬魚急毒性試驗
馬魚急毒性試驗
  • 野鼠防除技術開發與應用

野鼠防除技術與殺鼠劑效果評估

藉由無選擇性餵飼法方式投予,試驗殺鼠餌劑對野鼠的毒殺效果。判斷標準依據行政院環境保護署毒字第0950057292號令訂定,殺鼠餌劑在14天內對野鼠之致死率>80% 者視為具毒殺效果。

田間野鼠危害作物
田間野鼠危害作物 Rodents damage crops

常見野鼠
常見野鼠:a)田鼷鼠、b)赤背條鼠、c)小黃腹鼠、d)鬼鼠、e)溝鼠
Common rodents: a) Mus caroli, b) Apodemus agrarius, c) Rattus losea, d) Bandicota indica, e) Rattus norvegicus

新殺鼠餌劑之開發

鼠餌站之應用
鼠餌站之應用 Application of bait station

殺鼠劑藥效試驗-野鼠於取食後3-14天內死亡
殺鼠劑藥效試驗-野鼠於取食後3-14天內死亡。Rodenticide Toxicity Test - After feeding, rodents died within 3-14 days

 

【研究人員】

[ 蔡韙任 | 呂水淵 | 楊俊宏 | 盧欣怡 | 李悅怡 | 陳筱青 | 廖俊麟 | 陳綵慈 | 謝玉貞 | 張敬宜 ]

附加檔案

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